REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD EN PLANTAS CULTIVADAS IN VITRO
Carlos López Encinas
La elección, aislamiento y desinfección del explanto es el primer paso para el establecimiento in vitro de cualquier especie vegetal, y el éxito de esta fase depende en gran medida de toda una serie de parámetros relacionados con el propágulo (estado fisiológico, edad, estado de desarrollo, estado sanitario) y con el sistema seguido para su manipulación y esterilización [Franclet y col., Eds., Cell and tissue culture in forestry .Vol. I, Dordrecht, (1.987)].
De todas formas e incluso trabajando en condiciones óptimas y muy poco agresivas, los tejidos que forman el explanto sufren siempre en mayor o menor medida situaciones de estrés (desecación, daños mecánicos, daños en la desinfección, cambios en los potenciales hídrico, salino y osmótico al ser incubados en el medio de cultivo, cambios de pH...), y todo esto provoca la estimulación del metabolismo de los compuestos fenólicos. Estas sustancias van a provocar o conducir una serie de reacciones de hipersensibilidad, tales como la exhudación al medio del contenido de las células deterioradas, reaciones de estrés en las células vecinas de las dañadas, incluso aunque esas células no parezcan estar dañadas, y/o una muerte prematura de células específicas de esa zona o del lugar de la infección.
En respuesta al estrés o daño mecánico, en general el metabolismo fenólico presenta tres tipos de reacciones:
a) La síntesis de productos fenólicos monoméricos (fitoalexinas).
b) La síntesis de derivados polifenólicos.
c) La oxidación de componentes fenólicos preformados, que van a dar lugar quinonas y a material polimerizado (ligninas).
La síntesis de monofenoles puede conducir a la acumulación en tejidos no dañados de grandes cantidades de productos ya preformados, o dar lugar a la aparición de nuevos productos, las fitoalexinas, cuyo papel en los mecanismos de protección contra enfermedades es bien conocido. Así, una acumulación de material polimerizado, tipo lignina, va a actuar como una barrera física contra las invasiones microbianas y las quinonas y fitoalexinas van a actuar inhibiendo el crecimiento microbiano, trás la infección.
Un grupo especial de fenoles son aquellos que protegen las auxinas (tienen un efecto antioxidante inhibiendo la oxidación del ácido indolacético (AIA). En una planta completa existe un gradiente de inhibición de la degradación enzimática del AIA, que es inversamente proporcional a la edad del tejido, por ello la inhibición disminuye del ápice a la base del tallo [(Stonier, Eds., Colloques internationaux CNRS nº 193. Les cultures de tissus de plantes, Paris. ( 1.971)].
En general los fenoles son sustancias lábiles y fáciles de oxidar, y los productos de esta oxidación tienen caracter fitotóxico, por lo que son capaces de alterar procesos morfogenéticos y/o de crecimiento y desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidación, ya que trás su propia oxidacíon se convierten en potentes oxidantes.
Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar por una parte, los compuestos fenólicos protectores de auxinas, con objeto de estimular el crecimiento tisular y, por otro frente limitar la biosíntesis de fenoles y/o retardar o impedir su oxidación cuando llegan al medio de cultivo. Esta oxidación de fenoles provoca en los cultivos el "browning" o "Blackening" es decir un ennegrecimiento tanto del medio de cultivo como de los explantos, que suele concluir con la muerte o necrosis generalizada de los propágulos [(George y Sherrington, Eds., Plant propagation by tissue culture. Basingstoke. ( 1.984)].
Se han propuesto diversos métodos para eliminar o paliar los efectos negativos de estos compuestos fenólicos:
Para empezar es lógico suponer que evitar o suavizar los estreses que provocan o estimulan su biosíntesis, será el mejor método para impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan efectos tóxicos e inhibición del crecimiento. Una práctica adecuada sería cuidar que las condiciones fitosanitarias y fisiológicas de las plantas madres origen de los explantos fueran idóneas en la Fase O y que los métodos de desinfección y aislamiento fueran lo menos agresivos posibles en la Fase 1 de establecimento de los cultivos. Otros métodos que dan buen resultado si la síntesis de fenoles no puede evitarse son, la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del potencial redox (disminuyendo los agentes redox, o la disponibilidad de oxigeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH, incubación a temperaturas más bajas..., que persiguen reducir la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos. La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que trás su oxidación pasan a ser oxidantes muy potentes, invirtiendose su efecto positivo en el control de los fenoles [(Cleland, Biochem. 3: 480, (1.964)].
Determinados componentes de la formulación del medio de cultivo: citoquininas, micronutrientes: Mn++ y Cu++ (componentes de complejos enzimáticos) e incluso el potencial osmótico del medio pueden potenciar o inhibir la biosíntesis de compuestos fenólicos, su difusión y oxidación, interfiriendo activamente las reacciones de hipersensibilidad vegetal (ennegrecimiento, inhibición del crecimiento, necrosis) que provocan en condiciones in vitro.
Carlos López Encinas es
Colaborador Científico de la Estación Experimental de la La Mayora. CSIC.