Anticuerpos monoclonales, tecnologías en desarrollo
Guillermo Estivill Torrús
En el sistema inmune de vertebrados las células productoras de anticuerpos (linfocitos-B) presentan entre sus características la capacidad de producir dichas moléculas de manera específica, sintetizando cada linfocito-B activado un único y particular tipo de anticuerpo. Los tumores derivados de los linfocitos-B (mieloma, plasmocitoma) también producen anticuerpos pero de especificidad impredictible. Dado que todas las células tumorales se originan a partir de una única célula transformada, todas las descendientes producirán exactamente el mismo tipo de anticuerpo, con lo que éste se considerará monoclonal.
Cuando un animal es inmunizado con un determinado antígeno, se produce una respuesta con producción y proliferación de múltiples clones de linfocitos en el animal, obteniéndose de su sangre un suero policlonal, con una amplia variedad de anticuerpos de diferente especificidad y afinidad.
Un clon derivado de la reproducción de un único linfocito producirá, por definición, anticuerpos monoclonales, con especificidad única. La imposibilidad de obtener cultivos de clones celulares de linfocitos-B normales que produzcan los anticuerpos de especificidad deseada ha llevado a buscar las técnicas artificiales que emulen una situación similar. Con tal fin, se pueden llevar a cabo dos procedimientos: la transformación in vitro de los linfocitos B (p.e. mutagénesis mediada por medio de virus oncogénicos) y la fusión de las células productoras de anticuerpos con células de mieloma las cuales confieren inmortalidad a las células B. Esta última es la base de la tecnología de producción de anticuerpos monoclonales, iniciada en 1975 por Kohler y Milstein [Nature, 256:495] y que, en esta última década se ha desarrollado enormemente, constituyendo una herramienta muy valiosa en múltiples estudios.
La contribución al desarrollo de los anticuerpos monoclonales les llevó a dichos autores a obtener, junto a Niels Jerne, el Premio Nobel en Medicina en 1984.
La obtención de anticuerpos monoclonales consiste básicamente en inmunizar animales (ratones Balb/c generalmente) contra el antígeno para el que se desea producir anticuerpos. Tras obtener una respuesta adecuada se aislan del animal los linfocitos B esplénicos (capaces de producir anticuerpos) y se fusionan por medio de polietilenglicol con células de líneas establecidas de mieloma, tumor del sistema inmune.
Algunos de los híbridos (heterocariontes formados por recombinación genética) combinarán la capacidad de los linfocitos de producir los anticuerpos deseados con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro de las células de mieloma. Las células mielomatosas, además, han de ser deficitarias en hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPT) o timidina-quinasa (TK), enzimas necesarias para la vía silvestre de síntesis de precursores del DNA.
Tras la fusión, el genoma del linfocito compensa en el híbrido la deficiencia enzimática que presentaba la célula de mieloma por sí sola. Así, utilizando un medio de restricción adecuado se pueden eliminar las células de mieloma no híbridas, que son aquellas que no habrán compensado su carencia del enzima.
Una vez obtenidos los híbridos que establecerán ya una línea celular (hibridoma) se seleccionan aquellos que sean productores de las inmunoglobulinas específicas deseadas y, tras diversas fases de clonación para asegurar que las células obtenidas proceden de un único clon, los clones seleccionados se conservan por criopreservación en nitrógeno líquido y/o se expanden bien in vitro, en cultivo, bien in vivo, por inoculación en cavidad peritoneal de ratón. Así, se pueden obtener grandes cantidades de soluciones de medio de cultivo o de líquido ascítico desde donde las inmunoglobulinas específicas pueden purificarse por procedimientos convencionales.
La capacidad en un hibridoma establecido de producir los anticuerpos permanece indefinidamente y siempre es posible reconstituir la línea a partir de los clones congelados, con lo que la disponibilidad del anticuerpo producido así como la reproductibilidad del ensayo realizado con el mismo es permanente.
El desarrollo de esta técnica ha permitido ir introduciendo diferentes variedades metodológicas tales como el uso de linfocitos esplénicos estimulados por inmunización in vitro; la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (via fusión de linfocitos humanos con mieloma murino); producción, a partir de monoclonales, de anticuerpos bifuncionales sintetizados químicamente (p.e. por agregación o por reasociación química) o por medio de la fusión, bien entre un hibridoma y un linfocito procedente de una inmunización, bien entre dos hibridomas; y aplicación de tecnologías de DNA recombinante sobre hibridomas.
Los anticuerpos monoclonales han sustituido a los sueros policlonales para las investigaciones llevadas a cabo en las que se requiere ensayos de alta afinidad, sensibilidad, y precisión, o bien donde se necesita trabajar en condiciones que permitan aumentar la detectabilidad de una técnica.
Así, se emplean en la actualidad en técnicas tales como la detección de antígenos celulares de superficie, identificación de líneas hematopoyéticas de células humanas, diagnóstico con aplicaciones forenses sobre muestras de alimentos, bebidas y drogas ingeridas, aplicaciones de diagnosis y terapéuticas sobre infecciones víricas o bacterianas (unos pocos nanogramos de anticuerpo bastarían para diagnosticar una infección pero, de la misma manera, una mayor cantidad de anticuerpo puede ser utilizado para aplicar una terapia adecuada sobre el paciente), aplicaciones en inmunoterapia y diagnosis de tumores in vivo, aplicaciones en cromatografía de inmunoafinidad para purificar determinadas moléculas a partir de preparaciones mixtas, inmunológicas para identificar aquellas moléculas que mejor puedan confeccionarse como vacunas,.... En definitiva, un gran número de posibilidades que convierten a este técnica en una herramienta de gran utilidad en el campo científico y con un amplio horizonte aún por descubrir.
Guillermo Estivill Torrús es doctorando en Fisiología Animal.