Cultivo de óvulos vegetales y fertilización in vitro

Eva Domínguez Carmona y Carlos López Encina

 El cultivo de óvulos es una técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo, como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de zigotos y proembriones.
Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea, Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies.
El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.
El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.
A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos.
Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidas, son las siguientes :
  1. Polinización estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo y polinización in vitro del estigma. Este tipo de fertilización no requiere ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo. Se realiza satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.
  2. Polinización placentaria in vitro: En este método se aislan los óvulos con un trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de forma que los óvulos queden expuestos. De esta forma, se simplifican tanto el medio nutritivo como las manipulación necesaria para el aislamiento de los óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos así como un menor choque hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado. Esta técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.
En el caso de plantas que sufren aborto de embriones en estadios tempranos del desarrollo y en aquellos cruces en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario, es necesario rescatar los óvulos recién fecundados o incluso fecundarlos in vitro.
Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).

Eva Domínguez Carmona es becaria F.P.I. (C.S.I.C.). Carlos López Encina es Colaborador Científico del C.S.I.C., Estación Experimental La Mayora (Málaga).