Sistemática bacteriana: el cronómetro molecular

 Antonio Luque Lara y Juan José Borrego

 Los registros fósiles moleculares abarcan un buen número de constituyentes celulares: casi todos los marcadores quimiotaxonómicos pueden ser utilizados en este sentido. La química de la membrana o pared celular, y la composición de los sistemas de transporte electrónico son sólo los ejemplos más sobresalientes. Sin embargo, la evaluación cronológica de las relaciones filogenéticas requiere la utilización de moléculas con contenido informativo codificado, un cronómetro molecular ha de ser necesariamente un ácido nucleico o una proteína.
La hipótesis del cronómetro molecular asume que el número de cambios en las secuencias de estas moléculas es, a grosso modo, equivalente al tiempo transcurrido desde la divergencia de dos líneas evolutivas que comparten la molécula. Tanto proteínas como ácidos nucleicos han sido ampliamente utilizados como cronómetros moleculares en la resolución de filogenias de muy distintos grupos de seres vivos, pero son los ácidos nucleicos los que han tenido una especial incidencia en la elaboración del árbol evolutivo de los procariotas. Además, presentan la ventaja de que los cambios mutacionales quedan en su totalidad reflejados en la secuencia, evento que no ocurre en las proteínas, debido al carácter degenerado del código genético.
Un cronómetro molecular que permita detectar las relaciones evolutivas más amplias ha de cumplir las siguientes condiciones:
   Aunque la secuenciación de ácidos nucleicos es, comparativamente hablando, un método nuevo dentro de los estudios de sistemática, ha demostrado ser uno de los métodos más útiles para inferir la historia filogenética de los organismos. El mayor atractivo de esta técnica se basa en que los caracteres analizados (nucleótidos) son las unidades básicas de información, y que el banco de datos que se puede obtener en estos análisis es inmenso. Para utilizar las secuencias nucleotídicas en estudios filogenéticos éstas deben ser alineadas. El número y tamaño de las secuencias que deben ser alineadas depende del nivel de comparación elegido.
Las secuencias nucleotídicas analizadas por los distintos laboratorios son recopiladas regularmente en los bancos de datos informáticos, siendo el GenBank (contratado por el U.S. National Institute of Health) y el European Molecular Biology Laboratory (EMBL) los más conocidos e importantes. Todos estos datos están disponibles para que los autores puedan realizar estudios de sistemática.
La estrategia seguida en los estudios de sistemática mediante secuenciaciones, básicamente es la misma para las diferentes técnicas. Primero se identifica una secuencia diana que contenga una determinada cantidad de variaciones entre las distintas especies. Posteriormente, se aisla un gran número de copias de la secuencia diana de cada individuo que va a ser analizado. Estas copias se purifican y secuencian, finalmente, las secuencias homólogas deben ser alineadas y comparadas. Una vez comparadas, el grado de semejanza se estima con un coeficiente de similaridad y tras ello se agrupan los valores por métodos estándares.
En teoría, debido a la cantidad y calidad de información contenida, el cronómetro molecular por excelencia debería ser el DNA; sin embargo, su tasa de cambio es demasiado rápida como para que pueda utilizarse como indicador de procesos de especiación. Por ello, son los RNA ribosómicos los que se han constituido como principales cronómetros moleculares. Los RNA ribosómicos forman parte integral de la maquinaria de síntesis proteica básica de toda célula viva, sus tipos están universalmente distribuidos en todos los seres vivos, con alguna diferencia menor entre los reinos, su función es constante en toda la escala biológica y los tipos existentes presentan una variación en la longitud de la molécula adecuada para medir cualquier distancia filogenética.
Los ácidos ribonucleicos ribosómicos, al ser componentes esenciales de la vida poseen estructuras que se han conservado durante el transcurso de la evolución. Sin embargo, estas estructuras primarias están compuestas por regiones alternadas de alta y baja variabilidad. Las regiones con secuencias variables contienen información de bajo nivel filogenético, mientras que las regiones con secuencias preservadas contienen información de los eventos evolutivos más tempranos. Así mismo, existe una gran cantidad de copias de RNA ribosómico en una bacteria que esté en fase de crecimiento. De esta forma, el RNA ribosómico es un excelente marcador molecular para la reconstrucción de la mayoría de las relaciones filogenéticas. Los métodos de estudios más empleados son la secuenciación del RNA ribosómico 5S, 16S y 23S, y la hibridación DNA-RNA ribosómico [Fox y Stackebrandt, Methods in Microbiology, 19: 405-459 (1987); Goodfellow y O'Donell, Handbook of Bacterial Systematics. Ac. Press Ed. 3-56 (1993)]. Con la hibridación DNA-RNA ribosómico se pueden comparar secuencias nucleotídicas pertenecientes a distintos taxones debido a que los genes que las forman son más conservativos que los genes del genoma (Doi e Igarashi, J. Bacteriol. 90: 384-390 (1965); Dubnau et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 54:491-498 (1965); Moore y McCarthy, J. Bacteriol. 94:1066-1074 (1967); Nomura et al., Nature 219: 793-799 (1968)].
Inicialmente se comenzaron a realizar estudios de secuenciación del RNA ribosómico 16S [Fox et al., Int. J. System. Bacteriol. 27:44-57 (1977)]. Posteriormente, los estudios se extendieron al RNA ribosómico 23S. Las secuencias nucleotídicas constantes del RNA ribosómico 16S presentan la ventaja de proporcionar un sitio de iniciación adecuado para la elongación de los cebadores y así aplicar de forma más fácil la técnica de secuenciación.
La secuenciación completa del RNA 5S, debido a su pequeño tamaño, es más rápida y económica que las anteriores, e incluso la secuenciación de determinados fragmentos del RNAr 5S puede proporcionar una información adecuada. Dos miembros pertenecientes a un mismo género pueden poseer entre 114-116 pb comunes de 118-120 [Stackebrandt y Liesack, Handbook of Bacterial Systematic. Ac. Press. Ed. 152-194 (1993)]. Actualmente existe un debate sobre cuál es el análisis más adecuado para establecer relaciones filogenéticas. El análisis del RNA 16S parece ser el más adecuado con seres procariotas, ya que contiene aproximadamente 1550 pb frente a los 75-120 del RNAr 5S, por lo que pequeñas diferencias en los nucleótidos del RNAr 5S afectan mucho más al resultado final que en el caso del RNAr 16S.
Además de su utilidad en los estudios taxonómicos, la secuenciación del RNAr se ha aplicado en identificación bacteriana. Mediante el análisis de las secuencias parciales del RNA ribosómico 16S es posible encontrar patrones de secuencias específicos para grupos, especies o incluso serotipos bacterianos. Para la identificación de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeñas sondas específicas de la región variable del RNAr 16S [Festl et al., Appl. Environ. Microbiol. (1986); Romaniuk y Trust, FEMS Microbiol. Lett. 43: 331-335 (1987)]. Las diferencias en las regiones conservativas proporcionan así mismo secuencias para el diagnóstico de grupos de organismos relacionados y pueden ser usadas como dianas para sondas específicas de oligonucleótidos. Sondas específicas de RNAr 16S y 23S han sido aplicadas para establecer diferentes grupos y especies así como en la identificación de bacterias (Amann et al., Appl. Envirom. Microbiol. 58: 3007-3011 (1992)].
La hibridación con sondas específicas permite la identificación rápida de un gran número de aislados, al mismo tiempo que posibilitan la detección directa de microorganismos concretos en las muestras, usando un extracto de ácidos nucleicos como diana [Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15: 447-452 (1991); Ehrmann et al., System. Appl. Microbiol. 15: 453-455 (1992)]. La sensibilidad de las pruebas puede ser aumentada in vitro aplicando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Kleppe et al., J. Mol. Biol. 56: 341-361 (1971) ; Mullis y Faloona, Methods Enzymol. 155: 335-350 (1987); Ochman et al., Genetics 120: 621-623 (1988); Saiki et al., Sci. 239: 487-491 (1988); Innis et al., PCR Protocols. Ac. Press, Ed. (1990)]. A partir de un pequeño fragmento de DNA, es posible amplificar una secuencia diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales pueden ser secuenciados directamente o pueden ser utilizados como diana de una sonda específica. El uso combinado de sondas universales y específicas permite también estimar la fracción de determinados microorganismos dentro de un conjunto [Stahl et al., Appl. Envirom. Microbiol. 54: 1079-1084 (1988)]. Por último, se pueden realizar estimaciones de unidades formadoras de colonias utilizando métodos de hidribación de colonias in situ [Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15: 447-452 (1992)].

Antonio Luque Lara es el Técnico Responsable del Laboratorio de Microbiología del Depto. de Investigación y Desarrollo de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla S.A.
Juan José Borrego es Profesor Titular de Microbiología de la Universidad de Málaga