Sistemática bacteriana: el cronómetro molecular
Antonio Luque Lara y Juan José Borrego
Los registros fósiles moleculares abarcan un buen número
de constituyentes celulares: casi todos los marcadores quimiotaxonómicos
pueden ser utilizados en este sentido. La química de la membrana
o pared celular, y la composición de los sistemas de transporte
electrónico son sólo los ejemplos más sobresalientes.
Sin embargo, la evaluación cronológica de las relaciones
filogenéticas requiere la utilización de moléculas
con contenido informativo codificado, un cronómetro molecular ha
de ser necesariamente un ácido nucleico o una proteína.
La hipótesis del cronómetro molecular asume que el número
de cambios en las secuencias de estas moléculas es, a grosso
modo, equivalente al tiempo transcurrido desde la divergencia de dos
líneas evolutivas que comparten la molécula. Tanto proteínas
como ácidos nucleicos han sido ampliamente utilizados como cronómetros
moleculares en la resolución de filogenias de muy distintos grupos
de seres vivos, pero son los ácidos nucleicos los que han tenido
una especial incidencia en la elaboración del árbol evolutivo
de los procariotas. Además, presentan la ventaja de que los cambios
mutacionales quedan en su totalidad reflejados en la secuencia, evento
que no ocurre en las proteínas, debido al carácter degenerado
del código genético.
Un cronómetro molecular que permita detectar las relaciones
evolutivas más amplias ha de cumplir las siguientes condiciones:
-
Debe tener una distribución universal.
-
No debe estar sujeto a transmisión horizontal.
-
Ha de poseer una constancia funcional, de modo que la presión selectiva
que actúe sobre la molécula sea mínima.
-
La longitud de la secuencia debe ser suficiente para que las estimaciones
de semejanza tengan validez estadística.
-
La tasa de cambio, al menos en una parte de la molécula, debe ser
lo suficientemente baja como para permitir la detección de las relaciones
evolutivas lejanas.
-
Desde el punto de vista metodológico interesa que no sea excesivamente
larga para poder aplicar técnicas de secuenciación.
Aunque la secuenciación de ácidos nucleicos es, comparativamente
hablando, un método nuevo dentro de los estudios de sistemática,
ha demostrado ser uno de los métodos más útiles para
inferir la historia filogenética de los organismos. El mayor atractivo
de esta técnica se basa en que los caracteres analizados (nucleótidos)
son las unidades básicas de información, y que el banco de
datos que se puede obtener en estos análisis es inmenso. Para utilizar
las secuencias nucleotídicas en estudios filogenéticos éstas
deben ser alineadas. El número y tamaño de las secuencias
que deben ser alineadas depende del nivel de comparación elegido.
Las secuencias nucleotídicas analizadas por los distintos laboratorios
son recopiladas regularmente en los bancos de datos informáticos,
siendo el GenBank (contratado por el U.S. National Institute of Health)
y el European Molecular Biology Laboratory (EMBL) los más conocidos
e importantes. Todos estos datos están disponibles para que los
autores puedan realizar estudios de sistemática.
La estrategia seguida en los estudios de sistemática mediante
secuenciaciones, básicamente es la misma para las diferentes técnicas.
Primero se identifica una secuencia diana que contenga una determinada
cantidad de variaciones entre las distintas especies. Posteriormente, se
aisla un gran número de copias de la secuencia diana de cada individuo
que va a ser analizado. Estas copias se purifican y secuencian, finalmente,
las secuencias homólogas deben ser alineadas y comparadas. Una vez
comparadas, el grado de semejanza se estima con un coeficiente de similaridad
y tras ello se agrupan los valores por métodos estándares.
En teoría, debido a la cantidad y calidad de información
contenida, el cronómetro molecular por excelencia debería
ser el DNA; sin embargo, su tasa de cambio es demasiado rápida como
para que pueda utilizarse como indicador de procesos de especiación.
Por ello, son los RNA ribosómicos los que se han constituido como
principales cronómetros moleculares. Los RNA ribosómicos
forman parte integral de la maquinaria de síntesis proteica básica
de toda célula viva, sus tipos están universalmente distribuidos
en todos los seres vivos, con alguna diferencia menor entre los reinos,
su función es constante en toda la escala biológica y los
tipos existentes presentan una variación en la longitud de la molécula
adecuada para medir cualquier distancia filogenética.
Los ácidos ribonucleicos ribosómicos, al ser componentes
esenciales de la vida poseen estructuras que se han conservado durante
el transcurso de la evolución. Sin embargo, estas estructuras primarias
están compuestas por regiones alternadas de alta y baja variabilidad.
Las regiones con secuencias variables contienen información de bajo
nivel filogenético, mientras que las regiones con secuencias preservadas
contienen información de los eventos evolutivos más tempranos.
Así mismo, existe una gran cantidad de copias de RNA ribosómico
en una bacteria que esté en fase de crecimiento. De esta forma,
el RNA ribosómico es un excelente marcador molecular para la reconstrucción
de la mayoría de las relaciones filogenéticas. Los métodos
de estudios más empleados son la secuenciación del RNA ribosómico
5S, 16S y 23S, y la hibridación DNA-RNA ribosómico [Fox y
Stackebrandt, Methods in Microbiology, 19: 405-459 (1987);
Goodfellow y O'Donell, Handbook of Bacterial Systematics. Ac. Press
Ed. 3-56 (1993)]. Con la hibridación DNA-RNA ribosómico se
pueden comparar secuencias nucleotídicas pertenecientes a distintos
taxones debido a que los genes que las forman son más conservativos
que los genes del genoma (Doi e Igarashi, J. Bacteriol. 90:
384-390 (1965); Dubnau et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 54:491-498
(1965); Moore y McCarthy, J. Bacteriol. 94:1066-1074 (1967);
Nomura et al., Nature 219: 793-799 (1968)].
Inicialmente se comenzaron a realizar estudios de secuenciación
del RNA ribosómico 16S [Fox et al., Int. J. System. Bacteriol.
27:44-57 (1977)]. Posteriormente, los estudios se extendieron al
RNA ribosómico 23S. Las secuencias nucleotídicas constantes
del RNA ribosómico 16S presentan la ventaja de proporcionar un sitio
de iniciación adecuado para la elongación de los cebadores
y así aplicar de forma más fácil la técnica
de secuenciación.
La secuenciación completa del RNA 5S, debido a su pequeño
tamaño, es más rápida y económica que las anteriores,
e incluso la secuenciación de determinados fragmentos del RNAr 5S
puede proporcionar una información adecuada. Dos miembros pertenecientes
a un mismo género pueden poseer entre 114-116 pb comunes de 118-120
[Stackebrandt y Liesack, Handbook of Bacterial Systematic. Ac. Press.
Ed. 152-194 (1993)]. Actualmente existe un debate sobre cuál es
el análisis más adecuado para establecer relaciones filogenéticas.
El análisis del RNA 16S parece ser el más adecuado con seres
procariotas, ya que contiene aproximadamente 1550 pb frente a los 75-120
del RNAr 5S, por lo que pequeñas diferencias en los nucleótidos
del RNAr 5S afectan mucho más al resultado final que en el caso
del RNAr 16S.
Además de su utilidad en los estudios taxonómicos, la
secuenciación del RNAr se ha aplicado en identificación bacteriana.
Mediante el análisis de las secuencias parciales del RNA ribosómico
16S es posible encontrar patrones de secuencias específicos para
grupos, especies o incluso serotipos bacterianos. Para la identificación
de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeñas
sondas específicas de la región variable del RNAr 16S [Festl
et al., Appl. Environ. Microbiol. (1986); Romaniuk y Trust, FEMS
Microbiol. Lett. 43: 331-335 (1987)]. Las diferencias en las
regiones conservativas proporcionan así mismo secuencias para el
diagnóstico de grupos de organismos relacionados y pueden ser usadas
como dianas para sondas específicas de oligonucleótidos.
Sondas específicas de RNAr 16S y 23S han sido aplicadas para establecer
diferentes grupos y especies así como en la identificación
de bacterias (Amann et al., Appl. Envirom. Microbiol. 58:
3007-3011 (1992)].
La hibridación con sondas específicas permite la identificación
rápida de un gran número de aislados, al mismo tiempo que
posibilitan la detección directa de microorganismos concretos en
las muestras, usando un extracto de ácidos nucleicos como diana
[Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15: 447-452 (1991);
Ehrmann et al., System. Appl. Microbiol. 15: 453-455 (1992)].
La sensibilidad de las pruebas puede ser aumentada in vitro aplicando la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) [Kleppe
et al., J. Mol. Biol. 56: 341-361 (1971) ; Mullis y Faloona,
Methods Enzymol. 155: 335-350 (1987); Ochman et al., Genetics
120: 621-623 (1988); Saiki et al., Sci. 239: 487-491
(1988); Innis et al., PCR Protocols. Ac. Press, Ed. (1990)]. A partir
de un pequeño fragmento de DNA, es posible amplificar una secuencia
diana hasta unos cuantos microgramos, los cuales pueden ser secuenciados
directamente o pueden ser utilizados como diana de una sonda específica.
El uso combinado de sondas universales y específicas permite también
estimar la fracción de determinados microorganismos dentro de un
conjunto [Stahl et al., Appl. Envirom. Microbiol. 54: 1079-1084
(1988)]. Por último, se pueden realizar estimaciones de unidades
formadoras de colonias utilizando métodos de hidribación
de colonias in situ [Hertel et al., System. Appl. Microbiol. 15:
447-452 (1992)].
Antonio Luque Lara es el Técnico Responsable del Laboratorio
de Microbiología del Depto. de Investigación y Desarrollo
de la Empresa Municipal de Abastecimiento y Saneamiento de Aguas de Sevilla
S.A.
Juan José Borrego es Profesor Titular de Microbiología
de la Universidad de Málaga