Radicales libres de oxígeno y enzimas antioxidantes

Lucía Olalla Martín y José Manuel Matés

Durante el metabolismo aerobio se generan constantemente pequeñas cantidades de sustancias reactivas de oxígeno (ROS), incluyendo radicales hidroxilo (^.OH), aniones superóxido (O₂^.-), y peróxido de hidrógeno (H₂O₂), como respuesta a estímulos externos e internos. Estas mínimas concentraciones de ROS pueden ser indispensables en muchos procesos, como el sistema de señales intracelulares (que está relacionado con otros procesos como la proliferación celular y la apoptosis), la inmunidad, y la defensa contra microorganismos. Sin embargo, altas dosis o una eliminación inadecuada de ROS dan lugar a estrés oxidativo, que puede causar graves disfunciones metabólicas y daño a macromoléculas biológicas. Va a existir, por tanto, una relación entre los niveles de las enzimas antioxidantes y los tres tipos de moléculas mensajeras (factores de crecimiento, prostaglandinas y óxido nítrico) implicadas en la homeostasis celular, es decir, un equilibrio entre el mantenimiento de las condiciones estáticas o constantes en el medio interno celular y el nivel de ROS.
Una de las consecuencias del estrés oxidativo es la peroxidación lipídica, cuya prevención es esencial en todos los organismos aerobios, ya que los productos derivados de este proceso pueden interactuar con el DNA y son potencialmente mutágenos. Los epóxidos formados pueden reaccionar espontáneamente con centros nucleofílicos en la célula o unirse a los ácidos nucleicos (DNA y RNA). Esta reacción puede dar lugar a citotoxicidad, alergia, mutagénesis o carcinogénesis, dependiendo de las propiedades del epóxido en cuestión. En los organismos aerobios existen una gran variedad de sistemas de defensa antioxidante tanto enzimáticos como no enzimáticos, que se coordinan cooperativamente y protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalasa (CAT); además del ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), glutatión (GSH), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos fenólicos.
Por otro lado , también existe una relación entre los niveles de ROS celulares y el incremento ó descenso de las actividades de las enzimas antioxidantes. La adición de H₂O₂ causa un incremento, dosis dependiente, del mRNA de catalasa en células que se encuentran en crecimiento exponencial. Además, también se detecta un incremento de los niveles estacionarios del mRNA de GPX y SOD. Se han realizado experiencias en las que se ha observado que una sobreexpresión de alguna de las enzimas antioxidantes da lugar a un menor daño oxidativo. Cuando el DNA resulta dañado por radicales hidroxilo se produce la especie 8-oxo-2´-desoxiguanosina. La sobreexpresión de Cu/Zn-SOD y CAT causa un retardo en la acumulación de esta especie durante el crecimiento. Por otra parte, y como ejemplos del efecto protector de estas enzimas se expresó la catalasa peroxidasa de Cyanobacterium synechococcus en células animales, y las células transfectadas resultaron ser más resistentes a H₂O₂ que las células parentales. También, en otras cepas deficientes en SOD y CAT se observó un aumento de los niveles de O₂^.-. El descontrol de todas estas especies reactivas de oxígeno puede, por tanto, afectar a diferentes procesos esenciales del organismo, siendo una de las piedras angulares en la génesis de distintas patologías.
Superóxido dismutasa. Cataliza la reacción de destrucción de los radicales superóxido mediante su transformación en peróxido de hidrógeno, el cual puede ser destruido a su vez por las actividades catalasa o glutatión peroxidasa. O₂^.-+ O₂^.-+ 2H⁺ -> H₂O₂ + O₂ Se han identificado cuatro clases de SOD: una de ellas contiene un cofactor con dos átomos metálicos, uno de Cu y otro de Zn. Las demás presentan cofactores mononucleares de Fe, Mn o Ni. FeSODs y MnSODs presentan homologías en cuanto a sus secuencias y estructura tridimensional. Además poseen residuos quelantes idénticos en el sitio activo. En humanos existen tres tipos de SOD: la Mn-SOD mitocondrial, la Cu/Zn-SOD citosólica y la SOD extracelular (EC-SOD).
Mn-SOD es un homotetrámero de 96 kDa que contiene un átomo de Mn en cada subunidad. El átomo metálico cambia su estado de oxidación desde Mn(III) a Mn(II), volviendo de nuevo a Mn(III), durante los dos pasos que constituyen la reacción de dismutación del O₂^.-. La importancia biológica de la Mn-SOD se ha demostrado entre otros hechos por los siguientes:

1) La inactivación de los genes de Mn-SOD en E. coli aumenta la frecuencia de mutaciones cuando las bacterias crecen bajo condiciones aerobias.
2) La eliminación del gen en Saccharomyces cerevisiae aumenta su sensibilidad al oxígeno.
3) La falta de expresión de la enzima en ratones transgénicos da lugar a miocardiopatías y elevada mortalidad neonatal.
4) El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) induce selectivamente el mRNA de Mn-SOD, pero no el de Cu/Zn-SOD, CAT o GPX en tejidos de ratón y en células cultivadas.
5) La transfección de cDNA de Mn-SOD en células cultivadas les confiere resistencia a la citotoxicidad inducida por paraquat (una sustancia que induce la generación intracelular de O₂^.-), TNF-alfa y adriamicina.
6) La expresión de genes humanos de Mn-SOD en ratones transgénicos los protege de lesiones pulmonares inducidas por oxígeno y toxicidad cardiaca inducida por adriamicina.

Así pues, aunque el contenido de Mn-SOD en tejidos humanos es aproximadamente la mitad del contenido de Cu/Zn-SOD, la expresión de Mn-SOD es esencial para la supervivencia de la vida aerobia y el desarrollo de resistencia celular a la toxicidad inducida por las sustancias reactivas de oxígeno.
Cu/Zn-SOD (SOD-1) posee dos subunidades idénticas de unos 32 kDa, aunque a elevadas concentraciones de proteína en E. coli se encontró una estructura monomérica. Cada subunidad contiene un cluster metálico, el sitio activo, constituido por un átomo de Cu y otro de Zn. Mientras que la Mn-SOD existe en todos los tumores, y la relación de actividades Cu/Zn-SOD/Mn-SOD no difiere de la encontrada en tejidos normales, los tumores poseen menos Cu/Zn-SOD que los tejidos metabólicamente más activos. Por otro lado, la Mn-SOD es esencial para la vida, mientras que la Cu/Zn-SOD no lo es: los ratones con el gen Cu/Zn-SOD truncado aparentan ser normales y sólo muestran anomalías después de un daño traumático, mientras que los que tenían truncado el gen Mn-SOD no sobreviven más de tres semanas. Por otra parte, la supervivencia de ratones expuestos al 100% de oxígeno aumentó cuando se les inyectaron intravenosamente liposomas conteniendo SOD y CAT antes y durante la exposición.
EC-SOD es una glucoproteína tetramérica, que contiene Cu y Zn. Se ha encontrado en los espacios intersticiales de tejidos y también en fluidos extracelulares. La EC-SOD no es inducida por su sustrato u otros oxidantes, y su regulación en tejidos de mamíferos ocurre en primer lugar de un modo coordinado por citocinas, en vez de como respuesta de las células individuales a los oxidantes.
Catalasa. Es una enzima tetramérica, con cuatro subunidades idénticas de 60 kDa dispuestas tetraédricamente y contiene cuatro grupos de ferro-protoporfirina por molécula. Es una de las enzimas conocidas más eficientes, tanto que no puede ser saturada por H₂O₂ a ninguna concentración, catalizando su conversión en H₂O y O₂, para proteger a las células del H₂O₂ que se genera en su interior. Con dadores de H (metanol, etanol, ácido fórmico, fenoles...) presenta actividad peroxidasa. 2H₂O₂ -> 2H₂O + O₂ ROOH + AH₂ -> H₂O + ROH + A Por lo tanto, el H₂O₂ es catabolizado enzimáticamente en organismos aerobios por la catalasa y otras peroxidasas. En animales, el peróxido de hidrógeno se detoxifica mediante las actividades de la catalasa y la glutatión peroxidasa. Aunque la catalasa no es esencial para algunos tipos de células en condiciones normales, tiene un importante papel en la adquisición de tolerancia al estrés oxidativo en la respuesta adaptativa de las células. La catalasa captura el H₂O₂ antes de que pueda escapar de la célula y lo convierte en oxígeno molecular.
Glutatión peroxidasa. Está formada por cuatro subunidades idénticas, y cada una de ellas contiene un residuo de selenocisteína, que es esencial para su actividad enzimática. La GPX comparte su sustrato con la catalasa, pero además puede reaccionar de manera efectiva con lípidos y otros hidroperóxidos orgánicos, catalizando la reducción de diferentes hidroperóxidos (ROOH y H₂O₂) usando glutatión reducido (GSH), y así contribuye a la protección de las células de mamíferos contra el daño oxidativo. ROOH + 2GSH -> ROH + GSSG + H₂O Se han encontrado al menos cinco isoenzimas de GPX en mamíferos. Aunque su expresión es ubicua, el nivel de cada isoforma varía dependiendo del tipo de tejido. La GPX citosólica ó mitocondrial (GPX1) reduce los hidroperóxidos de ácidos grasos y el H₂O₂ a expensas del glutatión. La GPX1 y la GPX4 (PHGPX o fosfolípido hidroperóxido GPX) se encuentra en más tejidos. La GPX4 se localiza tanto en la fracción citosólica como en la membrana. PHGPX puede reducir directamente los hidroperóxidos de los fosfolípidos, peróxidos de ácidos grasos y hidroperóxidos de colesterol, que se producen en las membranas peroxidadas y en las lipoproteínas oxidadas. La GPX1 se encuentra predominantemente en eritrocitos, riñón e hígado, y la GPX4 se expresa mayoritariamente en células del epitelio renal y en los testículos. La GPX2 citosólica (o GPX-G1) y la GPX3 extracelular (o GPX-P) se detectan escasamente en la mayoría de los tejidos, excepto en el tracto intestinal y el riñón, respectivamente. Recientemente se ha encontrado un nuevo miembro, la GPX5, que es independiente de selenio y se expresa específicamente en el epidídimo de ratón.
El ciclo rédox del glutatión es la mayor fuente de protección contra bajos niveles de estrés oxidativo, pero la catalasa es más importante a la hora de proteger contra el estrés oxidativo severo. En células animales, y especialmente en eritrocitos humanos, la principal enzima antioxidante para la detoxificación de H₂O₂ es la GPX, ya que la catalasa presenta mucha menos afinidad por el H₂O₂.

Lucía Olalla Martín es becaria de F.P.I. y José Manuel Matés es Profesor Titular Interino de Bioquímica en la Universidad de Málaga