La interacción tomate-Cladosporium fulvum : Un modelo experimental
para el estudio de interacciones patógeno-planta (I)
Alejandro Pérez García
Cladosporium fulvum (Cooke, sin. Fulvia fulva) es el agente
etiológico responsable de la cladosporiosis del tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.), una enfermedad que presenta una sintomatología
en hojas caracterizada por la aparición de manchas amarillas en
el haz y marrones en el envés en correspondencia con las amarillas
del haz. En ataques graves gran parte de la superficie foliar queda inutilizada
para realizar la fotosíntesis, lo que se traduce en un descenso
en el rendimiento y la calidad del fruto. C. fulvum normalmente
ataca a cultivos bajo plástico pero su control es simple, ya que
es sensible a los fungicidas de uso más común y la mayoría
de las variedades de tomate cultivadas disponen de genes de resistencia
introducidos a partir de especies salvajes resistentes del género
Lycopersicon mediante programas clásicos de mejora. Por lo
tanto, desde un punto de vista económico C. fulvum no es
un problema importante. No obstante, desde un punto de vista puramente
científico C. fulvum sí que es importante, ya que
el estudio de su interacción con tomate está permitiendo
desvelar las bases moleculares de los mecanismos de resistencia de las
plantas frente a patógenos.
Lo que hace interesante a la interacción Cladosporium-tomate
como sistema modelo para el estudio de interacciones hongo-planta es el
hecho de que C. fulvum sea un patógeno biotrófico,
es decir, que no provoque la lisis de las células del hospedador.
Su ciclo biológico comienza con la llegada de una espora a una hoja.
Si la humedad relativa es elevada, la espora germinará y se desarrollará
una hifa delgada denominada hifa primaria que crece sobre la superficie
de la hoja. La penetración en el hospedador se produce a través
de los estomas, muy abundantes en el envés, y ocurre al azar. Una
vez en el interior de la hoja esta hifa engrosará su diámetro
y se formarán hifas secundarias que colonizarán extensivamente
los espacios intercelulares del parénquima esponjoso del mesófilo.
Dos semanas más tarde a través de los estomas emergerán
los conidióforos, a partir de los cuales se dispersarán las
esporas cerrándose el ciclo. Aunque las células del hospedador
no parecen sufrir cambios estructurales significativos, su degeneración
es aparente cuando la esporulación se hace extensiva. Al no provocar
necrosis de los tejidos, el aislamiento de fluído intercelular en
estadíos no terminales de la enfermedad ha permitido la purificación
de moléculas implicadas en el diálogo molecular entre patógeno
y hospedador. Como hemos mencionado, se conocen genotipos de tomate resistentes;
en estos casos, tan pronto con la hifa primaria entra en contacto con las
células del mesófilo se inducen las defensas del hospedador,
cuyo más claro ejemplo es la respuesta de hipersensibilidad (HR),
que se manifiesta por el colapso de las células del mesófilo
adyacentes a la hifa primaria que también se colapsa, frenándose
el desarrollo del hongo.
Los primeros estudios sobre la interacción Cladosporium-tomate
se remontan a mediados de los años 70 con estudios estructurales
a microscopía óptica y electrónica de barrido. Durante
los años 80 se caracterizaron moléculas presentes en el fluído
intercelular de interacciones compatibles (cuando hay desarrollo del hongo).
En este sentido, se describió la acumulación de fitoalexinas
(fenilpropanoides con actividad antimicrobiana) y de PRs (proteínas
relacionadas con la patogénesis) algunas también con actividad
antimicrobiana como glucanasas y quitinasas, como parte de los mecanismos
defensivos de la planta, así como el aislamiento y purificación
de proteínas extracelulares secretadas por el hongo. Entre estas
últimas destacan los elícitors AVR9 y AVR4, péptidos
muy abundantes en el fluído intercelular que cuando son inyectados
en hojas disparan la HR en plantas de tomate portadoras de los genes de
resistencia complementarios Cf-9 y Cf-4, respectivamente.
En la última década se ha profundizado en la biología
molecular de la intreracción. A partir de secuencias aminoacídicas
parciales de los péptidos AVR9 y AVR4 se diseñaron oligonucleótidos
degenerados que permitió el aislamiento de los genes de avirulencia
(que inducen HR) correspondientes, Avr9 (el primer gen de avirulencia
de origen fúngico clonado) [Van Kan et al, Mol. Plant-Microbe
Interact. 4:52-59 (1991)] y Avr4. La introdución
de estos genes en cepas de C. fulvum carentes de los mismos transfirió
a su vez la capacidad de inducir avirulencia en los genotipos de tomate
correspondientes, confirmándose así el modelo gen-a-gen para
estas combinaciones de genes de avirulencia/genes de resistencia. Aparte
de este carácter negativo para el hongo, la avirulencia, la actividad
biológica de ambos péptidos para C. fulvum se desconoce.
No obstante, la estructura tridimensional de AVR9 ha revelado una gran
similitud con inhibidores de proteasas [Vervoort et al, FEBS Lett.
404: 153-158 (1997)], pero tal actividad no ha podido ser demostrada.
Un aspecto a destacar es la manera con que cepas de C. fulvum han
conseguido escapar de la resistencia mediada por el gen de resistencia
Cf-4. Simplemente mutaciones puntuales en el gen Avr4 son
capaces de crear alelos "virulentos" del gen [Joosten et al, Nature
367: 384-387 (1994); Joosten et al, Plant Cell 9:
1-13 (1997)]. La ausencia de AVR4, sin embargo, no parece afectar a la
virulencia del hongo, al igual que ocurre con AVR9, ya que tanto la disrupción
génica de Avr9 como la existencia de cepas naturales de C.
fulvum carentes del mismo permite la colonización del hospedador
sin una apreciable disminución en virulencia.
Hay otras proteínas extracelulares de C. fulvum que son
indispensables para la virulencia del hongo. Este es el caso de las proteínas
ECP1 y ECP2. Aunque sus actividades biológicas se desconocen, la
disrupción de ambos genes causó una severa reducción
de la virulencia de C. fulvum [Laugé et al, Mol. Plant-Microbe
Interact. 10: 725-734 (1997)]. Sobre la base de que estas proteínas
eran factores de virulencia esenciales para el hongo, se postuló
que tales proteínas podrían ser a su vez elícitors
y que deberían existir genotipos de tomate capaces de reconocer
ambas proteínas y responder con HR, y por lo tanto, tales plantas
deberían ser portadoras de genes de resistencia potencialmente más
duraderos. Para identificar tales genotipos se utilizó el vector
de expresión PVX (virus X de la patata) ya que este virus tiene
la capacidad de replicarse en varias especies de solanáceas. La
idea era que un derivado del virus portando un cDNA codificante para un
posible elícitor permitiría una síntesis masiva de
tal proteína en el hospedador que se traduciría en HR si
el hospedador es portador del gen de resistencia complementario. El cDNA
de Ecp2 se insertó en el genoma de PVX y se inocularon diferentes
líneas de tomate originadas en antiguos programas de mejora de la
resistencia de tomate frente a C. fulvum. Cuatro plantas derivadas
de un mismo ancestro de L. pimpinellifolium mostraron necrosis (HR).
El análisis genético de la descendencia demostró que
el reconocimiento de ECP2 estaba basado en la presencia de un único
gen dominante designado Cf-ECP2 [Laugé et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95: 9014-9018 (1998)]. Todas las cepas de C. fulvum
analizadas hasta la fecha son avirulentas sobre estas plantas. La introducción
de Cf-ECP2 en cultivares de tomate comerciales demostrará si este
gen confiere una protección duradera frente a C. fulvum.
Idéntica aproximación experimental se siguió para
ECP1 y para otras tres proteínas extracelulares de C. fulvum:
ECP3, ECP4 y ECP5. En todos los casos se identificaron plantas de L. pimpinellifolium
que mostraron HR. En resumen, para todas las proteínas extracelulares
de C. fulvum analizadas hasta la fecha existen genotipos de Lycopersicon
capaces de responder específicamente con HR, o lo que es lo mismo,
las proteínas secretadas por C. fulvum parecen ser "antigénicas"
para la población de Lycopersicon [Joosten y De Wit, Annu.
Rev. Phytopathol. 37: 335-367 (1999)]. En próximos números
de Encuentros en la Biología comentaremos el análisis
molecular de los genes de resistencia de tomate frente a C. fulvum
y la posible explotación conjunta de genes de avirulencia y de resistencia
para el diseño de plantas transgénicas resistentes a enfermedades
de origen microbiano.
Alejandro Pérez García es Ayudante en el Departamento
de Microbiología de la Universidad de Málaga