Con esta idea en el laboratorio del profesor Peter Quail en la Universidad de California en Berkeley buscaron proteínas que pudieran interaccionar físicamente con la región core empleando el sistema del doble híbrido en levadura. Esta es una técnica que permite identificar proteínas que interaccionan in vivo con una proteína utilizada como «anzuelo», utilizando levaduras como sistema celular. En este caso, el anzuelo utilizado fue la mitad correpondiente al extremo carboxilo de la molecula de fitocromo B, que incluía la región core. Como resultado de este rastreo identificaron un número de proteínas que interaccionaban físicamente con el fragmento de fitocromo utilizado. Para determinar cuales de esas proteínas pudieran ser auténticos interactores del fitocromo con función en la señal de transducción, Quail y colaboradores sometieron a cada una de estas proteínas a exhaustivos «controles de calidad». Comenzaba el concurso «Miss Fitocromo». Las candidatas serían sometidas a duras pruebas que deberían superar para conseguir tan prestigioso título: debería interaccionar especificamente con fitocromo y no de forma promíscua con otras proteínas controles, no estaría mal tampoco si interaccionase en levadura con la región equivalente de fitocromos de otras especies, también debería ser capaz de mostrar interacción in vitro con el fitocromo (para evitar cualquier tipo de extraño artefacto en la técnica del doble híbrido), finalmente su interacción con el fitocromo debería verse afectada por las mutaciones identificadas en la región core que hace perder la actividad transmisora al fotorreceptor. De las 14 proteínas identificadas inicialmente tan sólo una, denominada PIF3, pasó todos los controles. Hasta el momento sólo se ha probado su interacción con dos de los fitocromos más abundantes en la planta, el fitocromo A y el B. La posible interacción con el resto queda por demostrar. Tres espectaculares resultados del mismo grupo de investigación confirmaron que estaban en el buen camino: 1) Por una increible casualidad, de forma simultánea en el mismo laboratorio una investigadora aisló un mutante de Arabidopsis afectado en la percepción de luz roja y roja lejana. Al identificar el gen afectado por la mutación resultó ser el gen de PIF3. 2) No menos espectacular fue el hecho de que ensayos in vitro demostraron que PIF3 se une al fitocromo entero y fotoactivo (es decir con el cromóforo unido y con capacidad de fotoconvertirse entre las fomas activa e inactiva). Además esta unión es fotorreversible y ocurre con la forma activa del fitocromo, Pfr, y no con la forma inactiva, Pr. Además, cuando el fitocromo contiene la región core mutada la interacción con PIF3 disminuye. 3) Cuando expresaron secuencias de cDNA de PIF3 en orientación sentido o antisentido en plantas transgénicas de Arabidopsis obtuvieron el resultado que cabría esperar a un componente de la cadena de transducción de la señal de los fitocromos. Las plantas transgénicas con el RNA sentido son parcialmente hipersensibles a la luz, es decir que a la misma cantidad de luz presentan una mayor intensidad de respuesta que las plantas controles no transformadas. Por el contrario, en las plantas transgénicas en la que la expresión del gen de PIF3 es bloqueada por el RNA antisentido, el resultado fue una significativa ceguera de las plantas a la luz roja y roja lejana. Cuando estas plantas son germinadas en oscuridad no presentan ningún tipo de diferencia con los controles no transformados, mostrando que las diferencias fenotípicas son dependientes de luz.
La pregunta inmediata que surge en este punto es: ¿qué clase de proteína es PIF3? Su secuencia muestra regiones de similitud a los dominios de unión al DNA y dominios de dimerización del tipo basic helix-loop-helix (bHLH). También presenta un dominio con la secuencia típica que actúa como señal para la localización nuclear de proteínas. En definitiva, que tiene todas las papeletas para ser un factor de transcripción. Para comprobar que la señal de localización nuclear era realmente funcional, transformaron celulas epidérmicas de cebolla con fusiones del gen marcador GUS y PIF3. De esta forma podrían localizar la presencia de la proteína por el color azul del producto de la reacción catalizada por el producto del gen GUS. La proteína quimérica se localizaba exclusivamente en el núcleo celular, mientras que la proteína GUS por si sóla se localizaba en el citosol. La interacción directa de un factor de transcripción como PIF3 con los fitocromos sugiere la posibilidad de que la vía de transducción de la señal que va desde la recepción de luz a los genes diana pudiera ser realmente corta. En el modelo propuesto por Quail y colaboradores tras la transformación de la forma inactiva (Pr) a la activa (Pfr) por absorción de luz roja, el fitocromo localizado en el citosol celular se transferiría al núcleo (como ha sido mostrado por otros grupos de investigación recientemente) donde interaccionaría con PIF3, tras lo cual actuarían sobre los promotores de los genes fotorregulados. Cabría esperar, por tanto, que PIF3 interaccionase con promotores de genes regulados por luz. En relación a esto, la regulación por luz de ciertos genes se ven afectados en las plantas que expresan el PIF3 en antisentido. Por otro lado, se sabe que los factores b-HLH se unen como un dímero a secuencias de DNA que contienen el motivo CANNTG conocido como E-box. En concreto el motivo CACGTG, un miembro de la familia de E-box presente en los promotores de muchos genes regulados por luz, podría ser el blanco de PIF3. Si realmente este es el mecanismo que opera en la regulación por luz de genes vegetales, habrá que explicar cuál es el papel de los distintos factores que han sido identificados por análisis génicos previamente como posibles componentes de la cadena de transducción. Por otro lado, ¿cómo puede explicarse la diferenciación de funciones entre los distintos fitocromos cuando un solo factor parece interaccionar con todos ellos?Tal vez algunos de los factores identificados por análisis genéticos sean moduladores de la acción de PIF3 o interaccionen también con los fitocromos iniciando diferentes cadenas de transducción de señal. Es posible también que PIF3 sólo interaccione con los fitocromos A y B y sean otros factores los que interaccionen con los fitocromos restantes.
El romance entre Fitocromos y PIF3 lo podéis seguir en los siguiente artículos:
Halliday K. J., M. Hudson, M. Ni, M.-M. Qin, P.H. Quail (1999). «poc1: an Arabidopsis mutant perturbed in phytochrome signaling because of a T-DNA insertion in the promoter of PIF3, a gene encoding a phytochrome-interacting bHLH protein.» Proc. Natl. Acad. Sci 96: 5832-5837.
Ni M., J. M. Tepperman, P.H. Quail. (1998). «PIF3, a phytochrome-interacting factor necessary for normal photoinduced signal transduction, is a novel basic helix-loop-helix protein.» Cell 95: 657-667.
Ni M., J. M. Tepperman, P.H. Quail. (1999). «Binding of phytochrome B to its nuclear signalling partner PIF3 is reversibly induced by light.» Nature 400: 781-784.
Whitelam G. C., K. J. Halliday (1999). «Photomorphogenesis: Phytochrome takes a partner!» Current Biology 9: R225-R227.
Francisco R. Cantón es Investigador Contratado en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga.