Para los amantes del cine bélico el título de este "Encuentro" probablemente no necesita explicación; para los que no lo son, diremos que los "navy seals" son tropas de élite de la marina norteamericana, comandos de "marines" capaces de atacar objetivos en tierra, mar y puestos a exagerar, también en el aire. Allá por la primavera de 1992, cuando el que suscribe comenzaba los trabajos experimentales de lo que a la postre sería una tesis doctoral en el campo de las interacciones patógeno-planta, recuerdo cómo mi habilidad para inyectar suspensiones bacterianas en el parénquima de hojas de tomate dejaba bastante que desear. Con alguna frecuencia, gotas de inóculo salían disparadas hacia mi rostro. Afortunadamente uso gafas y aquellos cristales se comportaron como auténticos cristales antibalas, protegiendo a mis ojos frente al agente (fito)patógeno. Más de una vez llegué a pensar que, o depuraba mi técnica de inoculación o llegaría a salir en la prensa como el primer ser humano infectado por una bacteria fitopatógena.

Pues bien, aquella premonición de estudiante de doctorado parece ser que no era tan descabellada. En 1995, F.M. Ausubel y colaboradores [Rahme et al. Science 268: 1899-1902 (1995)] publicaron un artículo muy provocativo en el que demostraban la existencia de factores de virulencia comunes necesarios para causar enfermedad en plantas y animales. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista en humanos que causa infeccciones en pacientes aquejados de fribrosis quística, quemaduras o cáncer. Setenta y cinco cepas de P. aeruginosa (30 de los cuales fueron aisladas de humanos) fueron ensayadas sobre Arabidopsis thaliana para producir enfermedad. De las 75 cepas sólo 2 causaron enfermedad sobre diversos ecotipos de Arabidopsis. Una de las cuales fue un aislado de origen humano (PA-14) que también era virulenta sobre ratón. En esta cepa se introdujeron mutaciones en dos genes de virulencia para animales, toxA y plcS, que codifican para una exotoxina y una fosfolipasa, respectivamente, y en un gen de virulencia para plantas, gecA, que codifica para un factor de transcripción en Pseudomonas syringae (una bacteria fitopatógena) que controla la secreción de piocianina, compuesto de fenazina tóxico. Tales mutaciones se tradujeron en una reducción significativa de la virulencia en ambos hospedadores, Arabidopsis y ratón, lo que indicaba que estos tres genes codifican para factores de virulencia comunes y necesarios para el desarrollo de la enfermedad en estos hospedadores tan diferentes. En ese mismo artículo Ausubel y colaboradores hipotetizaron que con ese modelo de trabajo, Pseudomonas-Arabidopsis, ellos deberían ser capaces de identificar factores de virulencia comunes adicionales. Tras mutagenizar PA-14 con el transposón TnphoA, identificaron 9 mutantes con virulencia reducida sobre Arabidopsis que también mostraban virulencia atenuada en ratón. De estos nueve, únicamente dos habían sido previamente descritos, el ya mencionado gacA, y dsbA, gen necesario para la formación de puentes disulfuros en el espacio periplásmico bacteriano. Además, uno de los 7 mutantes restantes presentaba el transposón insertado en el operón de biosíntesis de piocianina, lo que afectaba a la producción del compuesto [Rahme et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 13245-13250 (1997)]. Efectivamente, una planta, Arabidopsis, podía ser usada para identificar factores de virulencia frente a animales.

Más recientemente Ausubel y su grupo han extendido el modelo de infección por P. aeruginosa a un hospedador poco probable, el nemátodo Caenorhabditis elegans. Cuando PA-14 era crecida en un medio de cultivo con bajos niveles de fosfato y alta osmolaridad para ser usada como alimento para C. elegans los nemátodos morían en 24 h, lo que ellos describen como "muerte rápida" [Mahajan-Miklos et al. Cell 96: 47-56 (1999)]. Esta mortandad estaba asociada al estado de desarrollo del nemátodo; nemátodos en el último estadio larvario (L4) eran mucho más susceptibles que los adultos. El contacto entre la bacteria y el nemátodo no era necesario, ya que la actividad tóxica pudo ser identificada en el medio de cultivo. Una vez el modelo fue establecido, unos 3300 mutantes insertacionales de PA-14 fueron analizados para "muerte rápida". Siete mutantes atenuados fueron identificados, cuatro de los cuales producían menos pigmentos (necesarios para el color azul-verdoso de las colonias de P. aeruginosa). Este color es debido a metabolitos secundarios tricíclicos conocidos con el nombre genérico de fenazinas, como es la piocianina. Mediante PCR inversa los genes interrupidos por el transposón fueron identificados. En los tres mutantes que presentaban una producción normal de pigmentos, las inserciones fueron localizadas en los siguientes genes: hrpM, gen que controla patogenicidad en P. syringae; mexA, gen que codifica para un componente de una bomba de membrana; y orp, gen osmorregulador de la fosfolipasa C. Uno de los mutantes no pigmentados contenía una inserción en un gen no identificado pero con características de regulador, mientras que otros dos presentaban inserciones en el mismo gen, phzB, regulador de la síntesis de fenazina-1-carboxilato, intermediario en la síntesis de piocianina.

Aunque muchos hospedadores modelo han sido usados para identificar y caracterizar factores de virulencia, es generalmente bastante difícil, si no imposible, manipular genéticamente el hospedador para analizar las distintas hipótesis que pueden explicar el mecanismo de acción de un factor de virulencia. En este sentido, C. elegans como hospedador modelo es un buen organismo ya que se conocen muchos datos sobre su biología, su genoma ha sido completamente secuenciado, y lo que es más importante, se dispone de una colección de mutantes. Este conocimiento sobre C. elegans ha sido explotado por Ausubel y su grupo para profundizar en los mecanismos de patogenicidad de Pseudomonas. La piocianina es tóxica para la células porque es capaz de generar especies reactivas de oxígeno tóxicas como el ión superóxido y el peróxido de hidrógeno. Este grupo utilizó entonces mutantes de C. elegans que eran más resistentes (age-1(hx546)) o más sensibles (mev-1(kn1) y rad-8(mn163)) al estrés oxidativo. Como se esperaba, encontraron que la resistencia o susceptibilidad al estrés oxidativo correlacionaba con la resistencia o susceptibilidad a la "muerte rápida", indicando que la piocianina probablemente ejerce su efecto tóxico mediante la generación de especies reactivas de oxígeno. Una potencial estrategia de resistencia del hospedador podría ser la de bombear las toxinas fuera de las células. Usando mutantes que carecían de glucoproteína P (transportador de membrana) comprobaron como estos mutantes eran mucho más sensibles a la "muerte rápida". Por el contrario, cuando infectaron estos mutantes defectivos en glucoproteína P con derivados de PA-14 defectivos en la síntesis de piocianina, comprobaron que estos mutantes sobrevivían a la "muerte rápida". No obstante, tales mutantes eran susceptibles a derivados de PA-14 que producían niveles normales de pigmentos pero que a su vez eran defectivos para otros factores de virulencia. Globalmente considerados estos resultados parecen indicar que la glucoproteína P juega un papel crítico en la defensa del hospedador frente a piocianinas [Mahajan-Miklos et al. Cell 96: 47-56 (1999)].

La importancia de los resultados de Ausubel y su grupo se basa en la capacidad de alterar genéticamente tanto el hospedador como el patógeno para estudiar así el resultado de una interacción determinada. P. aeruginosa es un organismo relativamente fácil de manipular genéticamente y cuyo cromosoma ha sido secuenciado. Sobre C. elegans la información crece cada día y con ella la lista de mutantes. La combinación de estos dos sistemas modelo hace que esta interacción sea particularmente interesante, sobre todo si tenemos en cuenta que hemos entrado en una era postgenómica para ambos organismos. La demostración de que muchos factores de virulencia identificados con este modelo sean también necesarios para el desarrollo de la enfermedad en animales y plantas, hace que este modelo sea particularmente atractivo para la búsqueda de factores de virulencia. Mientras que un análisis de mutantes en ratones requeriría un número prohibitivo de animales, un ensayo preliminar en nemátodos permitiría el ensayo posterior en mamíferos de un pequeÒo número de mutantes avirulentos. A pesar de lo atractivo del modelo de nemátodos, es importante considerar que éste tiene varias e importantes limitaciones [Finlay Cell 96: 315-318 (1999)]. Las más obvia es quizás que C. elegans no es un hospedador natural de bacterias patógenas. La mayoría de los patógenos de mamíferos presentan una fina regulación de sus factores de virulencia, siendo inducidos en respuesta al medioambiente específico del hospedador o a sus moléculas. La temperatura (normalmente 37 ºC) es una seÒal clave, y podría asumirse que muchos factores de virulencia frente a mamíferos no serían expresados en el nemátodo que crece a temperatura ambiente. Otra importante dificultad es que C. elegans carece de un sistema inmune desarrollado y la mayoría de los factores de virulencia frente animales lo que persiguen es alterar o neutralizar la respuesta inmune del hospedador. Aunque este patosistema ofrece interesantes posibilidades, la universalidad de este modelo es algo que tiene que ser analizado en detalle. Por otro lado, la cepa PA-14 parece ser diferente a la mayoría de los aislados clínicos y que su capacidad de tener tan amplio rango de hospedador es una excepción, ya que sólo una pequeÒa fracción de los aislados de P. aeruginosa resultó ser patógena sobre plantas y animales. En general, la mayoría de los patógenos tienen un estrecho rango de hospedadores. Así, hay patógenos humanos como por ejemplo Salmonella typhi, Neisseria gonorrhoeae y E. coli enteropatogénico, de los que no existe un modelo animal experimental alternativo. La capacidad de PA-14 para infectar nemátodos, ratones y plantas, aparentemente contradice mucho de lo que hemos aprendido sobre la estricta regulación y mecanismos de especificidad de los factores de virulencia bacterianos. En nuestro laboratorio del Departamento de Microbiología trabajamos con pseudomonas patógenas de plantas, pero a pesar de que aún no se ha demostrado que tales bacterias sean capaces de causar infecciones en animales y de que nuestra técnica de inoculación es ahora más depurada, tenemos un especial cuidado en lo que a la manipulación de estas bacterias se refiere, no vaya a ser que nuestras pseudomonas sean "navy seals" del mundo microbiano y aquella premonición de estudiante de doctorado ... deje de serlo.

Alejandro Pérez García es Ayudante en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Málaga