Como continuación del número 59 de Encuentros en la Biología (diciembre 1999) en este «Encuentro» vamos a comentar los avances en el análisis molecular de los genes de resistencia de tomate frente a Cladosporium fulvum. Los genes de resistencia de las plantas son los genes responsables del fenómeno de resistencia frente a patógenos, específica de cultivar o específica de raza, que está mediada por el mecanismo de defensa conocido como «reacción de hipersensibilidad» (HR) (ver Encuentros en la Biología nº 66). Este tipo de resistencia se explica mediante la hipótesis gen-a-gen, que predice que para cada uno de los genes de avirulencia (Avr) de un patógeno dado debe existir en su hospedador un gen de resistencia (R) complementario responsable del reconocimiento del elícitor (producto del gen Avr), y por consiguiente, de la inducción de HR en la planta hospedadora.
Los genes de resistencia de tomate frente a C. fulvum Cf-2, Cf-4, Cf-5 y Cf-9 son conocidos desde hace bastante tiempo porque fueron introducidos desde especies salvajes de tomate en el cultivar comercial Money Maker (MM) mediante programas clásicos de mejora, resultando en las líneas casi isogénicas MM-Cf2, MM-Cf4, MM-Cf5 y MM-Cf9, respectivamente. Estos genes Cf están localizados en dos loci diferentes en el genoma de tomate. Cf-4 y Cf-9 se sitúan ligados en el brazo corto del cromosoma 1, mientras que Cf-2 y Cf-5 mapean en idénticas posiciones en el brazo corto del cromosoma 6 [Jones et al., Mol. Plant-Microbe Intreract. 6: 348-357 (1993)]. El gen de resistencia Cf-9 fue aislado usando transposones mediante una ingeniosa selección por pérdida de la capacidad de reconocimiento de Avr9, su gen de avirulencia complementario [Jones et al., Science 266: 789-793 (1994)]. Los otros tres genes de resistencia, Cf-2, Cf-4 y Cf-5 , fueron aislados mediante clonación posicional [Dixon et al., Cell 84: 451-459 (1996); Thomas et al., Plant Cell 9: 2209-2224 (1997); Dixon et al., Plant Cell 10: 1915-1925 (1998)]. El análisis de sus secuencias mostró que todos estos genes Cf codificaban para glucoproteínas de membrana con muchas regiones ricas en leucina (LRR). Por homología con otras proteínas, en estos dominios LRR, de los cuales cada proteína Cf tiene un número diferente, se piensa que reside la capacidad para actuar como sitio de unión a ligandos proteicos o interaccionar con otras proteínas. La localización extracitoplasmática del dominio LRR, hecho que hasta la fecha sólo ha sido confirmado experimentalmente para la proteína Cf-9 [Piedras et al., Plant J. 21: 529-536 (2000)], sugiere que las proteínas Cf pueden actuar directamente como receptores extracelulares de elícitors secretados por C. fulvum, indicando que la percepción de los elícitors ocurre extracelularmente.
Las comparaciones de secuencias sugieren que la variabilidad de las proteínas Cf debe residir en la mitad N-terminal, ya que las mitades C-terminal de las proteínas Cf-4 y Cf-9 son prácticamente idénticas, al igual que ocurre entre las proteínas Cf-2 y Cf-5. Por lo tanto, si hay una interacción directa entre los elícitors secretados por C. fulvum y las proteínas Cf, los aminoácidos variables de las regiones N-terminal deben determinar la especificidad de unión a ligando. Mutagénesis dirigida de las regiones N-terminal y experimentos de intercambio de dominios entre las diferentes proteínas Cf están revelando los dominios de estas proteínas que son determinantes para la especificidad del reconocimiento. La funcionalidad de las diferentes construcciones está siendo estudiada mediante el ensayo de transformación transitoria de Agrobacterium tumefaciens o agroinfiltración. En este ensayo, células de A. tumefaciens que contienen la construcción del gen Cf mutado pueden ser, infiltradas en hojas de tabaco transgénico que expresa el gen Avr complementario; infiltradas en tabaco que haya sido previamente inyectado con el elícitor en la misma zona, o co-infiltradas en hojas de tabaco con células de A. tumefaciens que contienen la construcción del gen Avr correspondiente. De esta manera se consigue la presencia en el mismo tejido tanto de la proteína de resistencia como del elícitor, que se debe traducir, si hay reconocimiento, en HR visible en forma de necrosis en las zonas de la hoja de tabaco infiltrada. Pero, ¿por qué se realiza el ensayo en tabaco si los genes Cf son de tomate? Desde un punto de vista práctico, la infiltración de hojas de tabaco es mucho más fácil que la de los foliolos de tomate, pero lo más importante es que la ruta de transducción de señales dependiente de Avr/Cf está tan conservada que los genes Cf funcionan en tabaco, patata y otras solanáceas, e incluso en lechuga [Van der Hoorn et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 13: 439-446 (2000)].
Los genes Cf están organizados en familias génicas de manera que los genes Cf funcionales están rodeados por genes homólogos designados Hcr (homólogos de los genes de resistencia frente a C. fulvum). Así, las plantas MM-Cf2 contienen 3 genes Hcr2 y las MM-Cf5 contienen 4 homólogos de los cuales Hcr2-5C es el gen Cf-5 funcional. Las plantas MM-Cf9 contienen 5 homólogos, donde Hcr9-9C es el gen Cf9 funcional que reconoce al elícitor AVR9. En las plantas MM-Cf4 la situación es similar, hay 5 homólogos, de los cuales Hcr9-4D es el gen Cf-4 funcional que permite la inducción de HR dependiente de AVR4. Pero, ¿son funcionales estos homólogos? Algunos datos así lo indican. Por ejemplo, algunos de los homólogos Hcr9 presentes en los loci Cf-4 y Cf-9 confieren resistencia mediante el reconocimiento de factores de avirulencia distintos a AVR4 y AVR9 [Laugé et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 11: 301-308 (1998)]. Así, en el locus Cf-4, el gen Hcr9-4E confiere resistencia mediada por un factor de avirulencia que ha sido denominado AVR4E [Takken et al., Plant J. 20: 2279-288 (1999)]. La identificación de clusters de genes quiméricos en plantas procedentes de cruces entre plantas MM-Cf2 y MM-Cf5 y plantas MM-Cf4 y MM-Cf9, indica que la organización en cluster de los genes Cf permite apareamientos defectivos de cromátidas y entrecruzamientos desiguales, lo que resulta en fenómenos de duplicación, recombinación y conversión génicas. Por ejemplo, en el locus Cf-2/Cf-5, ha sido identificada una recombinación intergénica que resultó en un gen quimérico que consiste en la secuencia codificante del péptido señal de Hcr2-2C fusionado a la secuencia que codifica a la parte madura de la proteína de Hcr2-5B [Dixon et al., Plant Cell 10: 1915-1925 (1998)]. En el locus Cf-4/Cf-9 han sido varias las recombinaciones intergénicas identificadas [Parniske et al., Cell 91: 1-20 (1997)]. De este modo, la organización de los genes Cf permite la diversificación de las secuencias y la generación de nuevas especificidades de reconocimiento.
Por lo tanto, extrapolando los datos obtenidos del estudio de la interacción Cladosporium-tomate, podemos decir que las plantas poseen un sistema de vigilancia versátil y adaptativo que les permite reconocer a proteínas foráneas. Como estas especificidades de reconocimiento parecen ser generadas al azar, es posible que no se limiten únicamente a reconocer moléculas de patógenos. Así, una generación constante de nuevas especificidades dentro de una población puede resultar en individuos con la capacidad de reconocer a proteínas de la propia planta. Estos individuos serán normalmente eliminados de la población porque mostrarían una HR sistémica, pero si este reconocimiento ocurre con baja afinidad o tales proteínas son únicamente inducidas bajo ciertas condiciones ambientales o estadios de desarrollo, puede causar el fenotipo denominado «disease lesion mimics» o lesiones imitadoras de enfermedad, descrito en especies como Arabidopsis, cebada, maíz y tomate. Curiosamente en tomate este fenotipo necrótico se asocia al locus Cf-2. Asimismo, es posible que algunos individuos sean capaces de responder con HR frente a proteínas de microorganismos no patógenos para su especie. Efectivamente, ECP2, una de las proteínas extracelulares de C. fulvum, es también reconocida específicamente por Nicotiana paniculata, cuando tabaco no es hospedador de C. fulvum. [Laugé et al., Plant J. 23: 735-745 (2000)]. Hasta la fecha no sabemos si el gen de resistencia de tabaco es otro Cf, pero no sería extraño, ya que se han identificado en manzano genes homólogos a los Cf de tomate que parecen estar implicados en la resistencia frente a la roña o moteado causado por el hongo Venturia inaequalis, la enfermedad más importante del manzano [Vinatzer et al., Mol. Plant-Microbe Interact. (en prensa) (2001)].
Alejandro Pérez García es Ayudante en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Málaga