En los últimos años el desarrollo de nuevas técnicas que permiten la detección y análisis de moléculas individuales está abriendo una nueva era en la investigación biológica (véase "Técnicas de detección y análisis de biomoléculas individuales" en Encuentros en la Biología 78, 2002). Una de estas técnicas es la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS), un análisis de fluctuaciones temporales de pequeños conjuntos de moléculas que combina una extremada sensibilidad con una elevada confianza estadística. Aunque la FCS fue introducida a principios de los años setenta, diversas dificultades experimentales impidieron su desarrollo práctico hasta los años noventa y solamente en los últimos años se han incrementado exponencialmente sus aplicaciones prácticas.

A diferencia de lo que ocurre con las técnicas clásicas de relajación, la FCS no requiere perturbar externamente el sistema sino que se analizan las diminutas fluctuaciones en la señal fluorescente que ocurren siempre espontáneamente. Para hacer posible una auténtica medida con resolución de molécula individual, deben emplearse muestras muy diluídas del fluoróforo (en el rango de concentración nanomolar) y debe enfocarse la señal luminosa láser excitadora en un volumen de medida del orden femtomolar. Las fluctuaciones de la señal fluorescente registradas son posteriormente sometidas a un análisis en serie temporal para generar la denominada función de autocorrelación de fluctuaciones normalizada:

El análisis de autocorrelación de la FCS convencional es potencialmente aplicable a cualquier proceso rápido que afecte a la capacidad fluorescente de las moléculas objeto de estudio (reacciones rédox, reacciones ácido-base, ligamiento a oxígeno, o isomerización, entre otros), así como a procesos de asociación/disasociación molecular que impliquen grandes cambios en la movilidad difusional de las fluoróforos. El rango de aplicaciones ya publicadas de la FCS en el campo de la biología incluye estudios de dinámica fotofísica de proteínas fluorescentes, análisis de dinámica conformacional, estudios de cinética bioquímica e interacciones entre macromoléculas.

Con el modo convencional de autocorrelación, el análisis de interacciones moleculares por FCS sólo se puede realizar apropiadamente si los tamaños moleculares aparentes de las especies reaccionantes y productos difieren en un factor de, al menos, 4 a 8. Esta limitación queda obviada por la variante de espectroscopía de correlación cruzada de fluorescencia de dos colores (DC-FCCS). El concepto de la DC-FCCS supone emplear dos haces de luz láser distintas para excitar dos fluoróforos distintos en un esquema confocal, tomar registro de las fluctuaciones de fluorescencia de ambos fluoróforos y finalmente hacer un análisis en serie temporal de la correlación cruzada de las fluctuaciones de una y otra señal. Aquí el parámetro de medida fundamental es la amplitud de la función de correlación cruzada, en vez de su evolución temporal (como ocurría en la FCS convencional). Es obvio comprender que la correlación cruzada de dos señales será alta cuando los dos fluoróforos coinciden en la únidad de volumen elemental al mismo tiempo, y será baja cuando no. De esta forma, si partimos de una molécula con un doble marcado fluorescente, será muy fácil seguir cualquier reacción que genere una ruptura de la misma que implique la separación física de los dos fluoróforos. Análogamente, si partimos de dos moléculas con distinto marcador fluorescente, en principio exhibirán muy baja correlación cruzada, pero si seguimos una reacción de ligamiento o fusión entre ambas especies, se detectará un significativo incremento en la correlación cruzada.

La mayor dificultad experimental del diseño confocal de la DC-FCCS consiste en el adecuado alineamiento y "confocalización" de los dos haces de luz láser. Estos problemas de manipulación quedan obviados en el diseño de DC-FCCS con excitación por dos fotones. En esta variante, sólo hace falta un láser para excitar distintos fluoróforos que generen espectros de emisión con mínimo solapamiento.

Finalmente, se ha propuesto un esquema que permite el análisis y cuantificación de agregados moleculares. Este enfoque se ha aplicado ya con gran éxito a la detección de agregados amieloides y agregados priónicos en el líquido céfalorraquídeo de pacientes afectos de la enfermedad de Alzheimer y de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, respectivamente.

La disponibilidad de nuevas generaciones de fluoróforos versátiles y resistentes, la generalización del empleo de la proteína verde fluorescente (GFP) y otras proteínas fluorescentes, la disponibilidad comercial de sistemas FCS de manejo relativamente fácil y los recientes desarrollos de variantes DC-FCCS permiten vaticinar un gran incremento en el número de aplicaciones concretas de la FCS en investigación biológica en el futuro inmediato.