El aumento de la explotación de bacterias beneficiosas y la necesidad de controlar patógenos bacterianos ha ido acompañado de la necesidad de avances biológicos y tecnológicos en el área de la identificación y clasificación bacteriana. La determinación de la diversidad genética dentro de las poblaciones microbianas es clave para establecer una taxonomía estable, que una vez se ha establecido permite idear protocolos de identificación y de diagnóstico de enfermedades; los nuevos aislados pueden ser rápidamente caracterizados y los grupos de cepas problemáticas pueden ser ubicados taxonómicamente. Centrándonos en el aspecto agrícola, un ejemplo de la diversidad existente y la necesidad de obtener un buen método de clasificación sería el género Xanthomonas, que engloba cepas fitopatógenas sobre 120 especies de monocotiledóneas y 260 de dicotiledóneas, incluyendo cultivos de gran importancia económica. Una de estas especies, X. campestris, engloba a su vez a 140 patovares que no se diferencian fenotípicamente entre sí salvo por su rango de hospedador. Otro ejemplo puede ser la especie Pseudomonas syringae, que se halla subdividida en 50 patovares [Dawson S.L. et al, Journal of Microbiological Methods 50:9-22(2002)]; este sistema de clasificación en patovares se adapta a las necesidades prácticas de los patólogos vegetales pero no refleja necesariamente las relaciones genéticas reales entre las cepas.
Se ha empleado una gran variedad de métodos para llevar a cabo la clasificación bacteriana, entre otros, los métodos serológicos (p.e. ELISA), los métodos bioquímicos basados en la utilización de diferentes sustratos (p.e. BIOLOG®), los análisis de ácidos grasos (FAME) o los análisis de isoenzimas (p.e. MLEE). Sin embargo la llegada de la biología molecular ha causado un cambio significativo en el tipo de herramienta utilizada, permitiendo una caracterización y clasificación mucho más rápida y fiable. Los protocolos que analizan ácidos nucleicos reducen el tiempo utilizado, parecen producir resultados más estables y repetitivos, con frecuencia reflejan más fielmente las relaciones filogenéticas y son útiles para ordenar las cepas en grupos coherentes. De hecho, la determinación de género y especie microbiana está basada aún en los métodos de hibridación DNA-DNA y en el caso de microorganismos no cultivables en los análisis de la secuencia del rDNA 16S y la comparación con sus "vecinos" más cercanos filogenéticamente, los que han proporcionado conocimientos sobre su biología y ecología [Louws F.J. et al, Annu. Rev. Phytopathol. 37:81-125(1999)]. Otras técnicas basadas en el DNA, incluyen la digestión del DNA total mediante endonucleasas que cortan de forma frecuente (REA) o infrecuentemente (PFGE, FIGE) los perfiles plasmídicos, los análisis de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y el análisis de los genes rDNA 16S. Estas técnicas son habitualmente utilizadas para obtener información para la clasificación dentro de los niveles de especie, subespecie y cepa (Figura 1).
| Familia | Género | Especie | Subespecie | Cepa |
| Secuenciación del DNA | ||||
| Secuenciación del rDNA 16S | ||||
| ARDRA, tRNA-PCR | ||||
| RFLP, PFGE | ||||
| RAPDs, AP-PCR, rep-PCR | ||||
Figura 1.- Esquema comparativo del nivel de resolución filogenético de diversas técnicas moleculares
En cualquier caso, muchos de los métodos moleculares para la clasificación e identificación de cepas están basados en la amplificación del DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), empleándose básicamente dos tipos de aproximaciones:
La primera implica la amplificación de uno o pocos fragmentos de DNA específicos, tales como partes del operón de rRNA, seguido de un análisis de restricción (ARDRA). Los nuevos fragmentos producto del análisis de restricción son resueltos en geles de electroforesis, generando un patrón de bandas de restricción de ácidos nucleicos característicos para cada cepa. Además la información obtenida de la secuencia del DNA sobre una región o gen en particular ha permitido la amplificación de fragmentos específicos de DNA que sirven para diagnosticar géneros, especies o cepas.
La segunda técnica hace uso de oligonucleótidos que actúan a modo de cebadores inespecíficos para la amplificación de numerosos fragmentos diferentes de DNA genómico. Cuando estos fragmentos son separados electroforéticamente por tamaño, los patrones de bandas resultantes generan una "huella dactilar" específica para cada grupo de microorganismos. Dentro de este tipo de protocolos se pueden diferenciar técnicas en función de los cebadores empleados, como cebadores cortos de secuencia arbitraria (RAPDs), o cebadores más largos en combi-nación con temperaturas de alineamiento más bajas (AP-PCR); o bien basados en la pre-sencia natural de elementos repetitivos de DNA esparcidos por el genoma de gran parte de las bacterias, uti-lizándolas como molde para la amplificación del DNA genó-mico (rep-PCR), el uso de tres familias de secuencias repetitivas cuya función exacta es desconocida: secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas (REP), secuencias consenso repetitivas intergénicas de enterobacterias (ERIC) y el elemento BOX.
Todas estas técnicas, basadas en el uso de la técnica PCR, permiten la amplificación selectiva de las distintas regiones genómicas localizadas entre ellas y que al resolverse electroforéticamente generan la huella dactilar del microorganismo, pudiendo detectarse diferencias genéticas incluso entre cepas de la misma es-pecie bac-teriana (Figura 1). De esta manera se ha conse-guido visua-lizar la huella dactilar de un microorganis-mo, de la mis-ma manera que se usa un código de barras en los comercios.
A partir de este momen-to, para localizar la presencia de una determinada especie o cepa, o bien para agrupar distintos microorganismos relacionados, sólo habrá que visualizar la huella dactilar de cada microorganismo. Ya ninguno tendrá escapatoria ... y todos serán reconocidos por los investigadores.
Jorge Rosales Bermejo es estudiante de Doctorado en el Departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la UMA